重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化

2018-12-10 - 血红蛋白

摘 要 目的:探索重组人血红蛋白的纯化方法。方法:将α、β珠蛋白串联基因克隆进pBV220表达载体,获得了高效表达,表达产物达细菌总蛋白的20%左右。该表达产物以包涵体形式存在,包涵体经洗涤后,用8 mol/L尿素溶解,先用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化后,又经Sephacryl-100凝胶过滤纯化。

重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化
重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化

结果:经两步纯化后重组人血红蛋白的纯度达90%左右。纯化产物经复性,具有与氧结合的能力。结论:成功地得到人重组血红蛋白的纯化方法。

中图分类号 Q503

目前血源短缺以及输血引起病毒感染和传播的情况屡有发生,因此,寻找安全、可靠、充足的血液来源成为紧迫任务。基因工程的理论和技术为这一问题的解决提供了依据。国外已成功地在大肠杆菌中

重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化
重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化

表达了人重组血红蛋白(rHb),但其表达量仅占总蛋白的5%~10%,且多以化学方式诱导表达,使重组血红蛋白的生产成本高。我们在以前重组血红蛋白上游研究工作的基础上[1],对rHb的下游纯化工作进行了初步尝试,希望找到简便易行的纯化方法。

重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化
重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 AKTA purifier,Amersham Pharmacia Biotech;AVL OMNITM-3型血气仪,瑞士AVL;超声破碎仪,宁波新芝电器研究所;CS930双波长薄层扫描仪,日本岛津公司。

1.1.2 质粒和工程菌 pBV220/α、β质粒含人血红蛋白α、β珠蛋白的串联基因,该质粒本室构建并保存,并经测序证实。α、β串联基因受PRPL启动子控制,其前后分别具有SD序列、起始密码子、终止密码子,α、β基因连接处由70 bp左右核苷酸间隔。表达α、β珠蛋白的JM109菌,本室保存。

重组血红蛋白 基因重组人血红蛋白的纯化

1.2 方法

1.2.1 工程菌的热诱导表达 少量阳性重组子接种于含氨苄青霉素50 mg/L的LB培养液中,培养过夜,次日按1%~2%接种培养,加入血红素40 mg/L,葡萄糖20 g/L,30℃培养A600达0.4~0.6时,42℃继续诱导培养4~5 h。

1.2.2 SDS电泳及纯度鉴定 用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质,上层胶浓度为5%,下层胶浓度为15%,120 V电泳5 h,凝胶用考马斯亮蓝染色。用双波长薄层扫描仪进行扫描测定纯度。

1.2.3 包涵体的制备、洗涤和溶解 发酵培养物1 L于4℃、4 000 r/min离心30 min后,细菌沉淀悬浮于一定体积的Tris-HCl-EDTA(TE)缓冲液中,加入溶菌酶,超声破碎(6×30 s,400 W),离心。

沉淀用9倍体积的1%Triton X-100洗涤,再分别用0.5、1、2和4 mol/L(含0.01 mol/L Tris-HCl,pH 8.7,2 mmol/L EDTA)尿素洗涤,分别保留上清和沉淀,以便检测目的蛋白在低浓度尿素中的溶解和洗涤程度。

洗涤好的包涵体溶于8 mol/L尿素(含0.05 mol/L Tris-HCl,pH 8.7,2 mmol/L EDTA,50 mmol/L二硫苏糖醇(DTT),0.1 mol/L NaCl)中,室温放置4~8 h,并不断搅拌,然后离心,用SDS-PAGE检测上清和沉淀中目的蛋白的分布。

1.2.4 Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析 柱体积为2.6 cm×30 cm,上样前柱子至少用2倍柱体积的平衡液(A液)平衡。A液为含8 mol/L尿素、25 mmol/L Tris-醋酸(pH 9.

0)、1 mmo/L EDTA和1 mmol/L DTT的溶液。经以2 ml/min的流速上样,起始洗脱缓冲液为A液,其后用含A液和B液进行梯度洗脱。B液为含0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素、25 mmol/L、Tris-醋酸(pH 9.

0)、1 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT的溶液。280 nm紫外监测,依次洗脱至不再出峰,分步收集洗脱液,进行SDS-PAGE。

1.2.5 Sephacryl-100凝胶层析 柱体积为2.6 cm×100 cm,上样(经Q-Sephacryl Fast Flow阴离子交换样品)前柱子至少用2倍柱体积的平衡液平衡,平衡液为8 mol/L尿素(含50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.

0,1 mmol/L EDTA,0.1 mol/L NaCl和1 mol/L DTT),上样体积约为柱体积的2%,流速控制为15 ml/h。280 nm紫外监测洗脱液,用自动收集器分管收集洗脱液,再用SDS-PAGE鉴定各管组分。

1.2.6 血红蛋白的复性[3~7] 经Sephacryl-100凝胶过滤纯化的样品,超滤除菌(以下试剂均经超滤除菌);用8 mol/L尿素(含0.05 mol/L Tris-HCl、pH 7.0,1 mmol/L EDTA,10 mmol/L GSH和1 mmol/L GSSG)分别稀释蛋白浓度为0.

2 mg/ml,依次缓慢对7、6、5、4、3、2 mol/L尿素(含0.05 mol/L Tris-Cl、pH 7.

0,1 mmol/L EDTA,10 mmol/L GSH和1 mmol/L GSSG)透析48 h。将两个亚基等摩尔混合(蛋白浓度为0.1 mg/ml),加入血红素(摩尔数与蛋白相同)、二连亚硫酸钠(摩尔数与蛋白相同)、Catalase(1 μg/ml),溶液用CO饱和,分别复性1、3、4 d。

用CO饱和的50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)在10 mmol/L NaCl溶液透析,逐渐去除尿素。浓缩蛋白浓度为20 mg/ml(约0.5 ml),通入氧气、光照、冰浴条件下,逐步将HbCO转换为HbO2。

1.2.7 重组血红蛋白的生物活性测定 在pH 7.0下,用AVL OMNITM -3型血气仪测定50%血氧饱和度时的分压血氧值(P50)。

2 结 果

2.1 α、β珠蛋白的等电点分析

为摸索离子交换分离的条件,首先用Goldkey软件对α、β珠蛋白的等电点进行了分析,α珠蛋白pI=8.93,β珠蛋白pI=7.14。

2.2 离子交换进行纯化

样品于经过平衡处理的强阴离子柱Q-Sepharose F.F,流速2.0 ml/min,平衡液洗去不保留组分。然后以A液和B液梯度洗脱,流速2 ml/min,分步收集洗脱液并进行SDS-PAGE分析。结果表明,蛋白主要位于吸收峰中,如图1所示。

在上述初步分离的基础上,减慢离子梯度对产物进行精细的分离纯化,结果α在电导8.0的峰中,β在电导28.4的峰中。经过强阴离子柱纯化,α、β单个组分的纯度分别达70%以上(见图2)。

2.3 凝胶过滤纯化

分别以Q柱洗脱的组分上样,分步收集洗脱峰(见图3a、3b),进行SDS-PAGE分析。电泳结果显示,经阴离子交换层析和凝胶排阻层析,珠蛋白纯度已达90%以上(见图4)。

2.4 重组血红蛋白的复性和生物活性的测定

我们在血红蛋白复性的实验中,发现复性时间的长短对血红蛋白的正确复性影响很大。复性1、3 d 的样品中未发现与氧结合的活性,至少需要复性4 d以上的样品中才发现与氧结合的活性。pH 7.0条件下测得样品的P50为19.9 mmHg,与文献报道[8]一致。初步表明基因重组的血红蛋白具有与氧结合的能力。

3 讨 论

重组血红蛋白以包涵体形式存在。包涵体溶解后进行纯化,实验室规模常采用的纯化方法主要有凝胶过滤法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法、反相层析法。一般来说,层析步骤越多,总回收率越低。我们根据血红蛋白α、β珠蛋白等电点不同的特点,首先利用离子交换层析的方法,选择Q-Sepharose F.

F作为第一步纯化用填料,将α、β珠蛋白分开。然后根据α、β珠蛋白分子量与层析介质孔径大小的对应关系,利用凝胶过滤法,选用Sephacryl-100作为第二步纯化用填料,进行进一步的纯化。

最终血红蛋白α、β珠蛋白的纯度可达到90%以上。因基因重组血红蛋白具有潜在的市场需求,故受到了国外各大生物公司的高度重视。近年来陆续在新的宿主(如酵母乐动vip体育官网、昆虫乐动vip体育官网、转基因动物、转基因植物)中进行rHb的表达[9~12]。

由于传统采供血系统不能解决病毒污染等问题,利用基因工程是大势所趋。最近绿十字公司利用基因工程生产的人基因重组白蛋白,达10 g/L,这对于血红蛋白的研究无疑是令人鼓舞的消息。

参考文献

1,张浩,王全立,冯起,等.人血红蛋白基因在大肠杆菌中的表达.生物化学与生物物理学报,1999,31(3)∶289~292

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